转录组全套分析范例文章来一篇 外汇技术分析案例范文模板大全集章节概括

研究结果

1. 测序质量和注释结果

研究物种为无参物种，文章首先对转录组的测序结果做基本的描述，包括测序得到的raw reads数、clean reads数、Q20、Q30质量、GC含量等，均无异常。然后使用Trinitiy对转录本进行组装，通过N50评价组装质量。对样本进行Pearson分析，评价生物学重复情况，相关性在0.77-0.98之间（R＞0.75），证明组内重复好，上述结果表明，此次测序获得了高质量的转录组数据。接着使用权威数据库对unigenes进行注释，发现60.2%的unigenes存在NR、SWISSPROT、KOG、KEGG注释，大部分基因已知，进一步说明基因测序结果的可靠性。

图1 Fig.1A：四大数据库注释结果；Fig.1B：NR数据库中序列相似物种；Fig.2：所有样本Pearson相关性计算结果。

2. 基因差异表达和富集分析

5组间比较共检测到2383个DEGs（FDR＜0.05，|log 2 FC|＞1），其中2192个（91.98%）主要来自对照组（Hy0）和4个处理组（Hy1、Hy3、Hy6和Hy9）的差异，利用韦恩图对各比较组之间共有和特有的DEGs结果进行统计，柱状图展示上下调基因数量。提示急性缺氧3h和9h可能是龙胆石斑鱼的两个关键胁迫时间。

图2 A：四个比较组DEGs韦恩图分析；B：每个比较组中上调和下调的 DEGs数量。

接着，对差异基因分别做GO和KEGG富集分析，了解基因功能。GO富集主要富集分类包括生物学过程分类中的细胞过程、代谢过程、单有机体过程；细胞成分分类中的细胞、细胞部分和细胞器；分子功能分类中的结合活性和催化活性。KEGG富集分析中，15-47通路显著富集，频率最高的7个通路包括脂肪酸生物合成、HIF-1信号通路、IL-17信号通路、先天性谷胱甘肽代谢缺陷症、代谢通路和真核生物核糖体的生物发生和药物代谢其他酶，可能与缺氧密切相关。此外，过氧化物酶体、p53信号通路、糖酵解/糖异生和脂质代谢也可能受到缺氧的影响。在Hy0与Hy3以及Hy0和Hy9的比较中，碳代谢、氨基酸生物合成和代谢途径是top3富集通路。

图3 对Hy0 vs. Hy3 (A和B)和Hy0 vs. Hy9 (C和D)中的DEGs进行KEGG富集分析的前20个通路结果。

3. 趋势分析

使用STEM软件对所有DEGs进行趋势分析（cluster number 20，相关系数0.7，p＜0.05），了解DEGs表达变化趋势。其中四个模块显著富集（有颜色的profile0、18、16、1）包括1842个DEGs。在profile0中，524个DEGs随着缺氧时间增加，表达持续下降；在profile 18中611个DEGs在1-3h上调，6-9h下调，总体上调；在profile 16中，434个DEGs下调，在中间阶段显著上调；在profile 1中，273个DEGs最终表达与起始相同。profiles 0和18模块中的基因变化趋势清晰，GO和KEGG富集分析与上述差异富集分析结果相似。

图4 对所有DEGs基于缺氧暴露时间进行趋势分析。A：20个表达谱；B：profile 0模块内的基因表达趋势；C：profile 18模块内的基因表达趋势。

4. WGCNA

对17695个RPKM＞1的基因进行WGCNA分析（最小power值为5、ME值为0.65、minModuleSize为50）共得到21个模块，每个模块有94-4674基因。三个模块（lightcyan1、tan、antiquewhite4）和缺氧显著相关。

图5 模块与缺氧暴露之间的关系。右侧的图例显示了-1（绿色）到1（红色）的模块-性状相关系数，表示从低到高的相关性。括号中的数字表示显著性（P＜ 0.05）。

GO和KEGG富集分析表明，这三个模块的基因主要参与代谢过程、细胞过程、单生物过程、细胞、细胞部分、结合和催化活性途径，与上述DEGs分析结果一致。虽然每个模块的KEGG通路不同，但有很多基因参与了几个共同的通路。如HIF-1信号通路、代谢通路、PPAR信号通路、糖酵解/糖异生、过氧化物酶体等，表明这些通路与珍珠龙胆石斑鱼的抗缺氧能力密切相关。此外，缺氧还影响细胞凋亡、p53信号通路和IL-17信号通路。

图6 三个显著模块富集分析结果。（A-C）lightcyan1、tan和antiquewhite4 模块GO富集分析结果。（D-F）lightcyan1、tan和antiquewhite4模块KEGG富集分析Top 20 通路。

接着作者分析了每个模块中核心或关键基因的共表达网络，在lightcyan1模块中网络图为32个基因和5个hub（ CRRSP55、Cht1、At2g39540、TL1 和 RPS21 ）；在tan模块中56基因和4个hub基因（ PLG、Cyb5a、RPL4、和Slc10a1 ）；antiquewhite 4模块网络为77个基因和5个hub基因（ CTSS、RAC2、lcp1、RGS5、 IGHM ）。这14个hub基因在三个模块中与其他基因高度相关，起着关键作用，可能与缺氧反应紧密相关。

图7 A：lightcyan1 模块基因共表达网络（32个基因，400个关系对）；B：tan 模块（56个基因，400个关系对）；C：antiquewhite4模块（77个基因，400个关系对）。

5. qRT-PCR基因表达模式验证

验证结果显示，qRT-PCR和RNA-Seq同时检测到的4个基因（CYP24A1、LDHA、IGFBP1和COX11）和三个基因（CYP8B1、MT-ND4和ACACB）分别普遍上调和下调，qRT-PCR和RNA-Seq均显示了一致的变化。qRT-PCR和RNA-Seq测定的10个基因相对表达量的一致结果支持了结果的有效性。

图8 qPCR验证RNA-seq数据中10个基因

#小结

1. 本研究使用RNA-Seq二代测序技术研究了不同持续时间（0 h、1 h、3 h、6 h和9 h）暴露于缺氧条件下的龙胆石斑鱼肝脏转录的变化，基于差异表达分析、STEM聚类和WGCNA分析寻找关键基因。筛选到2383个差异表达基因（DEGs）、两个具有明显表达趋势的基因集（profile 0和profile 18）以及三个缺氧特异性模块（lightcyan1、tan和antiquewhite4）。参与糖酵解和脂肪酸β-氧化的基因均上调，而参与有氧糖酵分解和脂肪酸合成的基因在低氧暴露期间下调。参与谷胱甘肽分解的和基因上调。参与过氧化物酶体抗氧化的和基因上调。检测到凋亡相关基因上调。说明厌氧糖酵解、脂肪酸β-氧化、谷胱甘肽代谢、过氧化物酶体抗氧化和细胞凋亡在龙胆石斑鱼对缺氧的转录组反应中起着关键作用。这些发现为理解石斑鱼适应溶解氧深度变化的分子机制提供了重要基础，从而减少了高密度养殖期间急性缺氧造成的损害。

2. 差异分析、富集分析、趋势分析、WGCNA是目前转录组常用方法，能将表达量和基因功能信息完美结合挑选关键基因。整体分析思路分为以下几个步骤：

①鉴定所有基因，评估测序质量并分析样本重复性情况；

②对所有基因进行差异分析，对筛选得到的DEGs进行富集分析和趋势分析；

③对趋势分析得到的显著富集模块内的基因进行富集分析；

④通过WGCNA划分基因到模块当中，结合样本信息或性状信息筛选关键模块，再对关键模块内基因进行富集分析。根据基因连通性数值，分析模块内基因调控关系，进一步鉴定hub基因。

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